多肽的纯化

多肽的纯化

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多肽有一个具有挑战性的分离问题¹，因为它们的氨基酸序列多种多样，翻译后修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化、糖基化等）或构象差异（当使用的分离机制不采用变性条件时）。人们需要考虑材料的来源（合成的或生物的），以及随后的分析或生产步骤所造成的任何限制。纯化技术包括反相（RPC）、离子交换（IEX）、亲水相互作用^2,3（HILIC）、静电亲水相互作用⁴（ERLIC），也称为离子对正常相⁵、疏水相互作用（HIC）和尺寸分离（SEC）。

分析分离受益于降低隔离物纯度或特征复杂性的方法。沉淀、溶剂萃取、亲和力分离都会增加感兴趣的多肽滴度，并减轻了对所选择色谱柱化学施加的色谱负担。基本分离模式放大了分子之间的差异，因此“一种方法适合所有问题”约束人们使用色谱柱的“理论板块”（N），而不是更强大的“化学选择性”（α，α）来获得或测量纯组分。分辨率方程中的第三个变量“容量系数”或容量比⁶（k'）是独立于柱几何或移动相流量的峰值保留率的度量。当它接近十个柱色谱空隙卷（等构）时，它的有效性会降低，虽然它不是一个有效的陈述，但当描述为组件的保留时间时，它反映了梯度分离斜率的变化。

因此，复杂样品的色谱最好使用正交化学方法，它们使用明显不同的机制。使用两种相同的基本方法（即RPC-C4：RPC-C18；低pH RPC：高pH RPC；HIC：RPC）在放大分析物混合物之间的差异方面不如使用真正的正交技术（即IEX：RPC；HILIC：RPC；NP：RPC）。第一维简化了混合物，因此第二（或第三）维需要分离的竞争分析物更少。因此，4个脯氨酸和一个丝氨酸的位置异构体的五肽混合物可能很难通过RPC，但HILIC可以检测丝氨酸在分子中位置的极性差异。同样地，脱氢产物导致位置异构体，天冬氨酸和异天冬氨酸，它们的疏水性相似，但极性差异显著。因此，虽然RPC对这些进行分离很困难，但RPC分离的混合物可以通过ERLIC⁷分解为单个成分。

与试图在单个色谱柱上完成所有操作相比，无论介质的效率如何（即亚于2微米UHPLC或表面多孔的SPP），都可以正交获得最大分辨率。彼此接近洗脱的组分具有相似的机械特性，但可能因电荷或其他功能群而差异显著。使用正交化学可以利用这一点。无论是相同的电荷，不同的序列洗脱，还是相同的疏水性，但具有不同的极性，都无关紧要——两者都受到单一化学方法的限制。第二种化学分离方法将导致成功分析或分离的概率更高（准备量表）。

梯度洗脱是多肽分离的首选

由于大型多肽扩散缓慢，RPC产生的峰值比小分子获得的峰值要大。梯度洗脱是最大限度地缩短分析时间的首选方法。梯度只是浓缩的等距曲线。如果泵入不确定数量的溶剂，成分就会被洗脱。因此，在陷阱或固相提取等应用中，最好限制柱空隙体积的数量，以防止弱保留物种意外洗脱。理想的加载/捕集体积比第一个感兴趣峰值的k'（洗脱体积减去空隙体积）少一个床层体积。如果进行定量蛋白质组学，目的是检测和量化所有多肽，重要的是要遵守这一体积限制。最安全的体积是一个色谱床负载，但由于低拷贝数多肽的检测限制，这是一个重大的妥协。解决方案是选择增加组分保留率的色谱条件，或改变柱的化学成分，以实现相同的持续时间。

键相二氧化硅的密度约为50%，因此很容易估计色谱空隙体积。那么它是微升的毫克包装。由于填料体积大约是质量的两倍（以微升为单位），因此可以从管体积中反向计算质量和色谱空隙体积（通常称为“柱体积”，不要误认为管体积）。

等量洗脱的多肽峰值宽度是分子量的函数。无论使用小分子测试探针色谱柱的效率如何，三肽将产生一个代表600个理论板块的峰值。即使梯度较浅，多肽的梯度洗脱也是首选，因为它导致比等梯度洗脱更尖锐的峰值。高效液相色谱吸附剂是在二氧化硅表面具有键合配体的多孔颗粒。形成疏水相的碳氢化合物基团通常是由十八（C18）、八（C8）或四（C4）碳组成的线性脂肪族碳氢化合物。碳氢化合物链的长度通常对蛋白质分离的有效性几乎没有影响。更常见的是，它会影响复苏。多肽必须进入孔隙，以便分配到结合相和被区别分离。多肽色谱仪效果差，部分原因是许多多肽太大，无法完全进入孔隙，这导致尺寸分离和疏水分配的组合，这体现在不同距离上以不同速度扩散时带（峰值）变宽。大多数多肽RPC分离是在孔隙约为300Å的颗粒柱上进行的，尽管一些肽（<~2,000兆瓦）也可以在120Å孔的颗粒上分离，并且非常大的多肽（例如抗体片段）使用1000Å孔柱。水流动相中的离子交换是一个较慢的扩散过程，因此使用1000Å和更大的孔隙或表面多孔介质来通过缩短扩散距离来提高分辨率。

疏水相的吸附/解吸方法

由于多肽的构象结构⁸需要精确数量的有机修饰分子，多肽在一个非常狭窄的有机修饰分子范围内从疏水表面解吸。这一特征解释了RP-HPLC分离和非常尖锐的色谱峰值中非常相似的肽的疏水选择性。RPC是使用含有三氟乙酸（TFA）、六氟丁酸（HFBA）或挥发性或挥发性或非挥发性缓冲盐等离子配对剂的水和乙腈（ACN）组合进行肽分离的最简单方法，具体取决于所采用的应用和仪器。

当多肽保留在柱子上时，会进行吸附/解吸步骤。解吸后，多肽和反相表面之间很少发生相互作用，随后的相互作用对分离的影响很小。因此，一旦肽开始移动，柱长会导致更大的加载能力，分辨率略有提高。颗粒大小和孔隙可访问性对给定表面化学的分离影响最大。多肽保留对修饰剂浓度微妙变化的敏感性使等距洗脱变得困难，因为必须非常精确地改变肽周围微环境中的有机修饰剂浓度才能均匀解吸。

对于需要保留原生构象的较大多肽，使用疏水相互作用（HIC）是推荐的疏水技术。同样，使用疏水表面，但配体密度约为RPC柱的十倍。此外，表面积较小的颗粒（即颗粒中的大孔隙）需要容纳这些较大的多肽分子，因为它们的扩散速度甚至比较小的肽慢，因此更近的表面减少了SEC-HIC混合机制的带宽。使用反向盐梯度，而不是使用有机溶剂来溶解、吸附和解吸蛋白质。该方法是蛋白质盐沉淀的色谱等效物，它依赖于蛋白质的脱水来诱导水溶液中聚集和沉淀。这是一个比RPC解吸要慢的过程，因此当盐被去除和蛋白质返回溶液时，人们可以获得更宽的色谱峰值。

由于HIC使用盐梯度，因此不应在离子交换分离（IEX）之前使用，因为盐促进IEX中的洗脱。虽然两者都是使用盐或pH梯度的高容量分离技术，但更好的组合是使用IEX作为第一步，然后是HIC（必要时进行透析，以从后续步骤中去除盐）。

在霍夫迈斯特系列各向沌盐^9,10中，HIC的选择性差异是可能的。这些不同盐在表面水化能力和选择性地保留（沉淀）疏水表面蛋白质混合物的能力方面有特定的离子效应。硫酸铵选择性最小，尽管使用最多。最好从用于保留的盐量中逐步增加和测试每种效果，因为不同的蛋白质在不同浓度的盐下沉淀。由于再水化的速度缓慢，如果水化率是分离的决定因素，而不是初始差分溶解度，则可以获得可能丢失的分离。

直径和长度对检测灵敏度的影响

色谱柱直径和长度不影响峰值分辨率，但确实影响样品加载、溶剂使用，并可能影响在某些情况下的检测灵敏度。流速和样品负载与柱直径平方比成正比。如果从一个长度移动到另一个长度，负载也与柱长度的比例成正比。因此，虽然减少直径会降低溶剂的使用量，但只要注射量/质量不按比例减少，就只能提高检测灵敏度。假设较小的内径柱本身会增加灵敏度是错误的，因为它都是成比例的。然而，当溶剂去除效率由质谱设计决定时，非常小的直径柱子在将高效液相色谱与质谱法（LC-MS）耦合时非常有用。使用2.1nnID RP-HPLC柱分离和收集了只有五纳米摩尔蛋白质的色氨酸消化物。质谱灵敏度因其通用的破坏性检测机制而更高。使用挥发性更强溶剂（如进行HILIC或ERLIC（离子对正常相位））的LC-MS检测可能比LC-MS RPC敏感100倍。

流动相和温度效应

多肽通常比在高有机浓度下更容易溶于水溶剂。温度升高有助于扩散，降低溶剂粘度，并增加这些水性有机混合物的溶解度，因此更尖锐，会导致早期洗脱峰值。然而，二氧化硅上的键相具有由其共价键强度施加的较高温度限制。因此，40°C是常见的温度，而60°C接近二氧化硅烷键强度极限。

当水溶剂含有有机修饰剂和离子对试剂或缓冲剂时，促进了RPC柱的解吸。洗脱是通过逐渐将有机溶剂分子的浓度与导致解吸所必需的浓度相匹配来实现的。有机修饰剂将它们从疏水表面溶解解并解吸，而离子对剂或缓冲液控制柱化学和多肽的极性。它使洗脱的pH值和离子对与zwitterionic多肽保持在单一的离子和疏水形式。

三氟乙酸是紫外线基RPC最常见的离子配对试剂。它被广泛使用，因为它在低波长下几乎没有紫外线吸附，并且挥发性好，便于从收集的馏分中去除。TFA通常以约0.1%（w/v）的浓度使用。然而，由于介电常数的变化，在210-220nm的监测时，TFA浓度恒定的梯度可能会发生基线偏移。随着乙腈（ACN）溶剂环境从水性到非水性，这会影响π-π电子相互作用，进而影响溶剂的紫外线吸附光谱（190至250纳米区域）。为了减少或消除这种基线漂移，在溶剂A中使用0.1%的TFA和在溶剂B中使用0.085%的TFA来平衡这些力。很重要的是使用优质的TFA且是在安瓿瓶中获取它。质量差或老化的TFA含有吸收紫外线的杂质，导致出现虚假的峰值。不建议使用LC-MS，因为它通过增加“矩阵效应”来降低了可检测性。相反，建议使用甲酸，最好是甲酸铵缓冲液来控制分析离子形态并控制洗脱pH值。

七氟丁酸（HFBA）在高达0.1% v/v的反相中显著保留了含有碱性氨基酸残基的肽，优于TFA、甲酸和醋酸。然而，信号抑制在LCMS中可能是显著的，因此紫外线检测对这两种离子配对剂都更可取。与TFA不同，在缓冲液B中使用更多的HFBA（缓冲液A：0.54%，缓冲液B：0.60%）来压平紫外线检测的基线。

有机酸通过质子化c端残基和Asp、Glu侧链来促进碱性化合物的电离，增强正离子质谱检测。挥发性缓冲液和离子配对试剂对于防止背景基质效应、信号抑制和MS源污染是必要的。使用缓冲液比自由酸更可取，因为它们可以控制电离和锐化峰，特别是在HILIC分离中。这些包括:甲酸铵或乙酸铵(2 - 10mM最佳;可以看到> 20mM对柱浓度的抑制效果)。醋酸0.1 - 1.0% v/v。甲酸(FA) 0.1 - 0.5% v/v。

乙腈（ACN）乙腈（ACN）是最常用的有机溶剂，因为它具有挥发性，很容易从收集的馏分中去除；它具有低粘度，最大限度地降低柱背压；它在低波长下几乎没有紫外线吸附；它随时可用。异丙醇通常用于大型或非常疏水的蛋白质。异丙醇的主要缺点是其粘度高和230纳米的紫外线截止波长。在乙腈中添加1-3%的异丙醇可以增加蛋白质回收率，就像使用C4等较短的烷基链长度柱一样。出于财务和监管原因，乙醇通常用于工艺规模的净化。

HILIC和ERLIC分离的流动相开始于高，非质子，水可混溶溶剂浓度，并通过增加缓冲强度和/或减少有机溶剂成分来解吸多肽。多肽基于极性和离子差异^2,3,4,5从裸二氧化硅到二醇等键化学的极柱表面，适合高有机移动相的离子交换化学，以及越来越多样化的两性离子相，利用多肽混合物中离子和中性极性基团的库仑相互作用。

pH值对肽分离的影响

由于酸性或碱性侧链的质子化或去质子化，肽分离通常对洗脱液pH值敏感。一般来说，与TFA、TEAP或磷酸盐在高酸性pH值下分离相比，在温和酸性pH值（6.0或6.5）下与醋酸三乙胺（TEAA）或磷酸盐缓冲液分离似乎会产生更好的峰值形状和分辨率，或至少更多的溶解成分。鉴于0.1% TFA等高酸性条件往往是反相肽层析的标准，这一观察结果意义重大。这里显示的结果表明，pH值6.0或6.5分离更有可能分离难以解决的组分。然而，应该指出的是，这些结果特定于使用的特定肽样本。这些结论可能适用于也可能不适用于其他样本。一系列试验分离有助于选择特定肽纯化的最佳条件。

分辨率可以通过使用不同的离子配对剂或更高的pH值来改变。使用TFA是肽分离的最佳起点。然而，考虑在低pH值或碱性pH值下使用磷酸盐或盐酸等缓冲剂。制备pH值4.4磷酸盐、pH值2.0磷酸盐和pH值6.5磷酸盐的10-20mM移动相溶液。将这些与0.1%的TFA、0.1%的HCl和10mM pH 10.0缓冲液（在聚合物或耐pH柱上）进行比较，以找到最佳的试剂和pH条件，以进行良好的肽分离。

蛋白质消化中的肽片段：脱酰化和氧化

蛋白质脱酰化导致中性天冬氨酸转化为酸性天冬氨酸及其位置异构体异乳酸，从而增加蛋白质的极性。因此，在中性pH值下，蛋白质变得有点亲水性。因此，使用ERLIC⁸或HILIC最好区分三种形式的肽，而不是RPC。

蛋白质消化中的肽片段：糖肽

胰蛋白消化的LC-MS分析提供了有关蛋白质结构的信息。然而，除非事先分馏简化混合物，否则糖肽将在RPC中与非糖基化肽共稀化。一种浓缩糖肽的简单方法⁵采用离子对正相（HILIC）条件。通过将TFA添加到样品和移动阶段一中，质子酸羧基和离子对都含有消化道中所有肽的胺，只留下糖样作为混合物中最极性的肽。随后通过SPE的HPLC进行HILIC色谱法产生了一个浓缩的选择性子集，仅由糖基化形式组成，然后可以酌情用RPC或HILIC条件进行LC-MS表征，也可以由IEX HILIC LC-MS进行去糖基化和分析。

参考资料和资源

Nest Group, Inc.网站www.nestgrp.com包含一套丰富的纯化应用和说明，包括反相（RPC）、离子交换（IEX）、亲水相互作用（HILIC）、静电亲水相互作用（ERLIC），也称为离子对正常相、疏水相互作用（HIC）和尺寸分离（SEC）。

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